Funktionelle Charakterisierung des Komplex I sowie strukturelle Untersuchungen an verwandten Enzymen

Medientyp: E-Book; Hochschulschrift

Titel: Funktionelle Charakterisierung des Komplex I sowie strukturelle Untersuchungen an verwandten Enzymen

Beteiligte: Schulte, Marius [Verfasser]; Friedrich, Thorsten [Akademischer Betreuer]

Erschienen: Freiburg: Universität, 2014

Umfang: Online-Ressource

Sprache: Deutsch

Identifikator:

Schlagwörter: NADH-Dehydrogenase ; Enzym ; NADH ; Kristallisation ; Online-Ressource ; NADH:Ubichinon Oxidoreduktase ; Komplex I ; Rnf-Komplex ; F420H2:Menachinon Oxidoreduktase ; F420H2:Methanophenazin Oxidoreduktase ; NADH:ubiquinone oxidoreductase ; complex I ; Rnf-complex ; F420H2:menaquinone oxidoreductase ; F420H2:methanophenazine oxidoreductase ; (local)doctoralThesis ; Hochschulschrift

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, Universität Freiburg, 2014

Anmerkungen:

Beschreibung: Zusammenfassung: Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, der respiratorische Komplex I, ist das erste und größte Enzym der oxidativen Phosphorylierung. Komplex I katalysiert die Übertragung zweier Elektronen von NADH auf Ubichinon, die mit der Translokation von vier Protonen über die Membran gekoppelt ist. Er hat eine molekulare Masse von 550 kDa und wird in Prokaryoten von 14 Untereinheiten aufgebaut, die in einem peripheren und einem Membranarm assembliert sind. Der Komplex trägt ein Flavinmononukleotid (FMN) und bis zu 10 Eisen-Schwefel (Fe/S)-Zentren als Kofaktoren für den Elektronentransfer. Die Kristallstruktur des Komplex I aus Thermus thermophilus wurde kürzlich bei einer Auflösung von 3.3 Å veröffentlicht. Evolutionär setzt sich der Komplex aus drei großen Modulen für den Elektronentransfer und die Protonentranslokation zusammen. In dieser Arbeit sollte eine stabile, saubere und homogene Präparation des Escherichia coli Komplex I etabliert werden. Der Effekt verschiedener Mutationen und Inhibitoren auf die Elektronentransfer- und Protonentranslokations-Aktivität sollte bestimmt werden. Homologe und Analoge von Modulen des Komplex aus anderen Organismen sollten produziert, präpariert und charakterisiert werden, um durch vergleichende Analysen Aussagen über den Mechanismus des Komplexes abzuleiten. Aus einem Überproduzenten wurde eine Präparation erarbeitet, die zwar laut SDS-PAGE keine Verunreinigungen durch andere Proteine enthielt, die aber durch Zusatz bestimmter Additive für höchstens 8 Tage stabil war. In der Präparation selbst waren Aggregate nachzuweisen, die deren Kristallisation verhinderte. Verschiedene Lipide binden mit unterschiedlich hohen Affinitäten an den delipidierten Komplex I, was auf spezifische Bindestellen hindeutet. Es wurde gezeigt, dass für die Unterscheidung von NADH und NADPH als Substrat hauptsächlich die elektrostatische Repulsion des E183 verantwortlich ist. Es wird vermutet, dass E95F für den „Auswurfmechanismus“ für NAD+ verantwortlich ist. Die Kopplung des Elektronentransfers mit der Protonentranslokation wurde über die Inhibition des Komplexes mit Zn2+ untersucht. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Komplex I zwei hoch-affine Bindestellen für Zn2+ besitzt, die sich vermutlich an der periplasmischen und der cytosolischen Seite der Protonenkanäle befinden. Die Daten führen zu einem Modell, in dem die Reduktion des distalen Fe/S-Zentrums eine konformative Bewegung induziert, die mit dem Öffnen und Schließen der Protonenkanäle im Membranarm gekoppelt ist

Zusammenfassung: The NADH:Ubiquinone Oxidoreductase, the respiratory complex I, is the first and largest enzyme of the oxidative phosphorylation. Complex I catalyzes the transfer of two electrons from NADH to ubiquinone, which is coupled to the translocation of four protons across the membrane. It has a molecular mass of 550 kDa and is built up by 14 Subunits in prokaryotes, which are assembled in a peripheral and a membrane bound arm. The complex harbours a flavin mononucleotide and up to 10 iron-sulphur (Fe/S)-cluster as cofactors for electron transfer. The crystal structure of complex I from Thermus thermophilus was recently published at a resolution of 3.3 Å. Under evolutionary perspective the complex is built up by three large modules for electron transfer and proton translocation. In this work, a stable , clean and homogenous preparation of Escherichia coli complex I should be established. The effect of different mutations and inhibitors on the electron transfer and proton translocation activity should be determined. Homologs and analogs of modules of the complex from other organisms should be produced, isolated and characterized in order to derive perceptions about the mechanism of the complex. From an overproducing strain a preparation was developed which according to SDS -PAGE contained no contamination by other proteins, but was not stable for more than 8 days by addition of certain additives. In the preparation aggregates were detected which prevented the crystallization. Various lipids bind with high affinities to the delipidated complex I, suggesting specific binding sites. It has been shown that the electrostatic repulsion of E183 is mainly responsible for the discrimination of NADH and NADPH as substrate. It is believed that E95F is responsible for the "eject mechanism” for NAD+ . The coupling of electron transfer with the proton has been studied bythe inhibition of the complex with Zn2+. In this work it is shown that complex I contains two high-affinity binding sites for Zn2+ which are probably located at the periplasmic and the cytosolic side of the proton channels. The data lead to a model in which the reduction of the distal Fe/S-cluster induces a conformational change that is coupled to the opening and closing of proton channels in the membrane arm.

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