Characterizing the leakage mechanism of thermoresponsive liposomes

Medientyp: E-Book

Titel: Characterizing the leakage mechanism of thermoresponsive liposomes

Beteiligte: Schnur, Johannes [Verfasser]; Heerklotz, Heiko [Akademischer Betreuer]

Körperschaft: Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Erschienen: Freiburg: Universität, 2021

Umfang: Online-Ressource

Sprache: Englisch

DOI: 10.6094/UNIFR/176015

Identifikator:

Schlagwörter: Liposom ; Calcein ; Fluoreszenz ; Membran ; Krebs ; Thermoresponsive Liposomes ; Isothermal Titration Calorimetry ; (local)doctoralThesis

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, Universität Freiburg, 2020

Anmerkungen:

Beschreibung: Abstract: Liposomal drug delivery systems are capable of accumulating encapsulated drugs in tumor tissue. However, they often fail to achieve a fast and reliable drug release, leading to a poor drug distribution across the target tissue. Thermoresponsive- or Thermosensitive Liposomes (TSLs) are liposomal drug delivery systems that allow the controlled release of their content when triggered by mild hyperthermia (T≈41°C). This mechanism has shown to provide a higher bioavailability of the drugs at the tumor while reducing systemic toxicity and, thus, the severity of side effects. Despite being under investigation since the late 1970s, only few formulations have reached the stage of clinical trials. One challenge in designing TSLs is the lack of systematic data on how their various components affect the physicochemical properties of the membrane on a molecular level. Another challenge is the limited understanding of how plasma proteins interact with TSLs and thus improve or interfere with a controlled release of their payload. This knowledge would allow for a more rational design of TSLs, which, in turn, might pave the way for a more widespread clinical application of TSLs. To characterize the release behavior of TSLs, a fluorescence lifetime based leakage assay was performed, using calcein-loaded large unilamellar vesicles (LUVs). The physical state of the membrane was further investigated using time-resolved anisotropy decays and fluorescence lifetime distributions of dihexaphenyltriene (DPH). Interactions of TSL components with human serum albumin (HSA) were characterized by isothermal titration calorimetry (ITC) and chromatographic experiments. The performance of published TSL formulations was compared under equal conditions by measuring calcein leakage in TRIS-buffer and 50 % human plasma at body temperature and mild hyperthermia conditions. Here, lysolipid-containing TSLs (LTSLs) and stealth-TSLs (sTSLs) showed the highest temperature selectivity in TRIS-buffer. Temperature selectivity refers to the ratio of release at 41 °C to stability at 37 °C. In 50% (V/V) human plasma, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphodiglycerol (DPPG2) containing TSLs performed similarly well to LTSLs. The effect of individual TSL components on the content release and the physical state of the membrane was then further characterized by preparing large unilamellar vesicles (LUVs) containing systematically varying amounts of frequently used TSL components. This showed, among other things, that the addition of DSPE-PEG 2000 — which is often used to prolong the circulation time of TSLs — also increases the initial release rates of TSLs. The incorporation of cholesterol reduced the speed and total amount of dye-release. However, LUVs containing 15 mol% cholesterol and 5 mol% DSPE-PEG 2000 combined led to high amount of released dye and the emergence of a lag phase of 5 – 10 min before leakage started. This lag-phase correlated with the change in membrane dynamics observed by DPH anisotropy on the same time scale. LUVs containing 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) and 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (18:0-LysoPC) showed a much-increased release at 41 °C. In a joint project with Daniel Eckhardt, Jessica Steigenberger, Louma Kalie, Ulrich Massing, Georg Pabst, and Heiko Heerklotz, such LUVs were shown to form an interdigitated phase at 10 mol% 18:0 LysoPC. At the phase transition, the melting of gel- and interdigitated phase leads to the formation of local spots of high lysolipid concentration which causes a transient destabilization of the membrane allowing for a fast drug release. LUVs containing 18:0-LysoPC or DPPG2 showed a significantly improved release behavior in presence of human plasma. Therefore, the interactions of 18:0-LysoPC and DPPG2 with human serum albumin (HSA), the most abundant protein in blood plasma, were further investigated by isothermal titration calorimetry (ITC) and chromatographic experiments. HSA increased the release of 18:0 LysoPC-containing LUVs by extracting lipids from the outer leaflet at 41 °C, thus increasing asymmetry stress, leading to an increased dye-release. By contrast, HSA interacted with DPPG2 containing LUVs by adsorbing onto the liposome surface

Abstract: Liposomale Wirkstoffträgersysteme sind in der Lage, eingekapselte Zytostatika im Tumorgewebe anzureichern. Häufig gelingt es ihnen jedoch nicht, eine schnelle und zuverlässige Wirkstofffreisetzung zu erreichen, was zu einer schlechten Verteilung der Wirkstoffe im Zielgewebe führt. Thermoresponsive oder thermosensitive Liposomen (TSLs) sind liposomale Trägersysteme, welche die kontrollierte Freisetzung ihres Inhalts ermöglichen, wenn sie Temperaturen von etwa 41 °C ausgestetzt sind (milde Hyperthermie). Es hat sich gezeigt, dass dieser Mechanismus eine höhere Bioverfügbarkeit der Wirkstoffe am Tumor bewirkt und gleichzeitig die systemische Toxizität und damit die Schwere der Nebenwirkungen im Vergleich zur Verabreichung freier Zytostatika reduziert. Obwohl sie seit den späten 1970er Jahren untersucht werden, haben nur wenige TSL-Formulierungen das Stadium klinischer Studien erreicht. Ein Problem bei der Entwicklung von TSLs ist der Mangel an systematischen Daten darüber, wie die verschiedenen TSL-Komponenten die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Membran auf molekularer Ebene beeinflussen. Eine weitere Herausforderung ist das begrenzte Verständnis, wie Plasmaproteine mit TSLs interagieren und so eine kontrollierte Freisetzung ihres Inhalts verbessern oder stören. Ein besseres Verständnis dieser Probleme könnte die Basis für eine zielgerichtetere Entwicklung von TSL-Formulierungen sein. Dies wiederum könnte den Weg für den Einsatz von TSL-Formulierungen in der Krebstherapie ebnen. Um das Freisetzungsverhalten von TSLs zu charakterisieren, wurden Leakage-Experimente calceinbeladener Vesikel durchgeführt. Der physikalische Zustand der Membran wurde durch die Messung zeitaufgelöster Anisotropie und Fluoreszenzlebensdauerverteilungen von Dihexaphenyltrien (DPH) untersucht. Die Wechselwirkungen der TSL-Komponenten mit Humanserumalbumin (HSA) wurden durch isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) und chromatographische Experimente charakterisiert. Das Freisetzungsverhalten bereits veröffentlichter TSL-Formulierungen wurde unter gleichen Bedingungen verglichen, indem die Calcein-Leakage in TRIS-Puffer und 50 % (V/V) menschlichem Plasma bei Körpertemperatur (37 °C) und bei leicht erhöhter Temperatur gemessen wurde. Dabei zeigten lysolipidhaltige TSLs (LTSLs) und Stealth-TSLs (sTSLs) in TRIS-Puffer die höchste Temperaturselektivität. Temperaturselektivität beschreibt dabei das Verhältnis von Freisetzung bei 41 °C zu Stabilität bei 37 °C. In 50 % (V/V ) Humanplasma zeigten neben LTSLs auch DPPG2 haltige TSLs eine sehr hohe Temperaturselektivität. Die Wirkung einzelner TSL-Komponenten auf die Freisetzung des Inhalts und den physikalischen Zustand der Membran wurde weiterhin charakterisiert, indem unilamellare Vesikel (LUVs) hergestellt wurden, die systematisch variierende Mengen dieser Komponenten enthielten. Dabei zeigte sich unter anderem, dass die Zugabe von DSPE-PEG 2000, das häufig zur Verlängerung der Zirkulationszeit von TSLs verwendet wird, auch die initiale Geschwindigkeit der Calcein Freisetzung erhöht. Der Zusatz von Cholesterin verringerte die Geschwindigkeit und die Gesamtmenge der Farbstofffreisetzung. LUVs, die sowohl 15 mol% Cholesterin als auch 5 mol% DSPE-PEG 2000 enthielten, zeigten jedoch eine Verzögerungsphase von 5 bis 10 Minuten, bevor die Freisetzung einsetzte. Diese Verzögerungsphase korrelierte mit der Veränderung der Membrandynamik , die durch DPH-Anisotropie gemessen wurde. LUVs, die 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC) und 1-Stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (18:0-LysoPC) enthielten, zeigten bei 41 °C eine stark erhöhte Freisetzung. In einem gemeinsamen Projekt mit Daniel Eckhardt, Jessica Steigenberger, Louma Kalie, Ulrich Massing, Georg Pabst und Heiko Heerklotz wurde gezeigt, dass solche LUVs bei 10 mol% 18:0-LysoPC eine interdigitierte Phase bilden. Beim Phasenübergang führt das Schmelzen von Gel- und interdigitierter Phase zur Bildung kleiner Bereiche mit hoher Lysolipidkonzentration, die eine transiente Destabilisierung der Membran bewirken und so eine schnelle Freisetzung ermöglichen. Darüber hinaus zeigten LUVs, die 18:0-LysoPC oder 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-diglycerin (DPPG2) enthielten, ein signifikant verbessertes Freisetzungsverhalten in 50 % (V/V) menschlichem Blutplasma. Daher wurden die Wechselwirkungen von 18:0-LysoPC und DPPG2 mit HSA, dem am häufigsten vorkommenden Blutprotein, durch ITC und chromatographische Experimente untersucht. HSA erhöhte die Freisetzung von 18:0 LysoPC-haltigen LUVs durch Extraktion von Lipiden aus der äußeren Membranschicht bei 41 °C Dadurch ergab sich eine zusätzliche Asymmetriebelastung, was zu einer erhöhten Freisetzung führte. Im Gegensatz dazu interagierte HSA mit DPPG2-haltigen LUVs durch Adsorption an deren Liposomenoberfläche

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