Herstellung von Liposomen mit einer asymmetrischen Verteilung von Phosphatidylserin und deren Verwendung als Modellmembran

Medientyp: E-Book; Hochschulschrift

Titel: Herstellung von Liposomen mit einer asymmetrischen Verteilung von Phosphatidylserin und deren Verwendung als Modellmembran

Beteiligte: Wüller, Marcus [Verfasser]; Schubert, Rolf [Akademischer Betreuer]

Erschienen: Freiburg: Universität, 2015

Umfang: Online-Ressource

Sprache: Deutsch

DOI: 10.6094/UNIFR/10053

Identifikator:

Schlagwörter: Schubert, Rolf 1919-2011 ; Membran ; Phosphatidyl-serin ; Phosphatidylserin-Decarboxylase ; Verteilung ; Herstellung ; Rekonstitution ; Gentransfer ; Pharmazie ; Liposom ; Membranlipide ; Asymmetrie ; Modell ; (local)doctoralThesis ; Hochschulschrift

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2015

Anmerkungen:

Beschreibung: Zusammenfassung: Herstellung von Liposomen mit einer asymmetrischen Lipidverteilung von Phosphatidylserin und deren Verwendung als ModellmembranMarcus Wüller, 03/2015Neben der Verwendung als vielfältiges drug carrier system stellen Liposomen auf Grund ihrer Phospholipid-Doppelschicht ein besonders geeignetes Zellmembran-Modell dar. Die häufig ungleiche bzw. asymmetrische Verteilung von Lipiden zwischen der inneren und äußeren Membranseite, die viele natürliche Membranen aufweisen, kann jedoch bis heute nicht ausreichend durch solche Membranmodelle abgebildet werden. Vor diesem Hintergrund sollte in der vorliegenden Arbeit eine liposomale Modell-Membran generiert werden, welche eine asymmetrische Verteilung von Phosphatidylserin (PS) aufweist. Auf Grund seiner Bedeutung in physiologischen Prozessen, wie der Blutgerinnung oder der Apoptose, steht insbesondere dieses Phospholipid und seine asymmetrische Verteilung verstärkt im Fokus der Membran-Forschung.Zur Herstellung dieser asymmetrischen Liposomen wurden zwei Methoden auf Ihre Eignung untersucht. Zum einen die enzymatische Modifizierung durch Decarboxylierung von Phosphatidylserin mittels Phosphatidylserin-Decarboxylase (PSD) und zum anderen der bereits durch die Arbeiten von Joachim Momm und Martin Holzer an diesem Lehrstuhl etablierte proteinvermittelte Lipid-Transfer zwischen Donor- und Akzeptor-Vesikeln mittels des nicht-spezifischen Lipid-Transfer-Proteins (ns LTP).Auf Grund der in der Literatur beschriebenen Eigenschaft der isolierten PSD, in vitro nur in membranähnlichen Strukturen aktiv zu sein, wurde ein Protokoll zur Protein-Rekonstitution in die liposomale Membran entwickelt. Nach der Rekonstitution konnte jedoch in Abwesenheit von Detergens keine Aktivität der PSD in der liposomalen Membran nachgewiesen werden, so dass die Herstellung asymmetrischer Liposomen über diesen Weg nicht realisiert werden konnte.Der ns-LTP vermittelte Lipid-Transfer von PS zwischen Donor- und Akzeptor-Vesikeln konnte hingegen erfolgreich zur Herstellung asymmetrischer Liposomen eingesetzt werden. Dieser wurde mit Hilfe der Free-Flow-Elektrophorese (FFE) untersucht. Durch diese elektrophoretische Methode konnte zum einen der Transfer des unter den Versuchsbedingungen anionisch geladenen PS verfolgt und zum anderen die Donor- und Akzeptor-Liposomen präparativ getrennt werden. Der Lipid Transfer wurde in Bezug auf die Temperaturabhängigkeit und die eingesetzte Menge an Transfer-Protein, während des Prozesses, genauer charakterisiert.Die durch den proteinvermittelten Lipid-Transfer erzeugten asymmetrischen Liposomen wurden eingesetzt, um die transversale Lipiddiffusion (Flip-Flop) von Phosphatidylserin zu untersuchen. Durch die Einführung einer Fluoreszenz-basierten Markierung der Liposomen konnte der Prozess erstmals mit Hilfe der FFE untersucht und die Halbwertszeit (t1/2) des Flip Flops in einer asymmetrischen Modellmembran zu 22,2 ± 1,9 h (T = 20 °C) ermittelt werden

Zusammenfassung: Preparation of liposomes with an asymmetric lipid distribution of phosphatidylserine and their application as biomimetic model membraneMarcus Wüller, 03/2015Beside their application as drug carrier system liposomes are widely used as biomimetic model membrane due to their phospholipid bilayer. Developing an accurate liposomal model various properties of biological membranes must be taken into account. The cytosolic membrane skeleton, the lipid composition as well as the asymmetric distribution of lipids between the two leaflets of the bilayer are crucial characteristics. Lipid asymmetry has been shown to be present in many endosomal and plasma membranes. Especially the asymmetric distribution of phosphatidylserine (PS) plays an important role in cellular signaling. The externalization of PS for instance is involved in phagocytosis and blood coagulation.Up to date this asymmetry could not sufficiently be generated in a liposomal model. To reach this goal two methods have been investigated: On the one hand, a protein mediated lipid transfer between different vesicle populations by means of a non-specific lipid transfer protein (ns-LTP), which has already been established in our institute by Joachim Momm and Martin Holzer. On the other hand an enzymatic modification via phosphatidylserine decarboxylase (PSD), a key enzyme of lipid metabolism which catalyzes the formation of phosphatidylethanolamine (PE) by decarboxylation of phosphatidylserine (PS).For a successful decarboxylation the naturally membrane bound PSD must be first reconstituted into the liposomal bilayer. Experiments have been done in order to find optimal reconstitution parameters. Performing this reconstitution protocol no activity of the enzyme was observed in absence of detergent. The detergent itself prevents the stability of a lipid asymmetry and therefore the PSD with its absolute requirement for detergent in vitro could not effectively be used for the preparation of asymmetric vesicles.However, the ns-LTP mediated lipid transfer between donor and acceptor vesicles was successfully used to generate asymmetric liposomes. The transfer was observed by free flow electrophoresis (FFE). This electrophoretic method enables an investigation of the transfer of PS, which is under experimental conditions anionic charged as well as a preparative separation of donor and acceptor membranes subsequently. The transfer was characterized with regard to temperature and quantity of protein. The degree of asymmetry induced in the donors membrane was varied by modifying the total lipid ratio between donor and acceptor vesicles.The asymmetric vesicles prepared by protein mediated lipid transfer were used to study the transverse lipid diffusion (flip flop) of PS. By introducing a fluorescent label into the liposomal membrane for the first time an analysis of this process via FFE was feasible. The half-life of the PS flip-flop in an asymmetrical model membrane was determined to 22.2 ± 1.9 h (T = 20 °C)

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