Minimally trans-complementation-dependent HBV reporter vectors

Medientyp: E-Book

Titel: Minimally trans-complementation-dependent HBV reporter vectors

Beteiligte: Zimmermann, Peter [Verfasser]; Nassal, Michael [Akademischer Betreuer]; Radziwill, Gerald [Sonstige]; Thimme, Robert [Sonstige]

Körperschaft: Universitätsklinikum Freiburg, Klinik für Innere Medizin II ; Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Biologie

Erschienen: Freiburg: Universität, 2023

Umfang: Online-Ressource

Sprache: Englisch

DOI: 10.6094/UNIFR/233147

Identifikator:

Schlagwörter: Hepatitis-B-Virus ; cccDNA ; Reportervirus ; (local)doctoralThesis

Entstehung:

Hochschulschrift: Dissertation, Universität Freiburg, 2023

Anmerkungen:

Beschreibung: Abstract: Reporter-kodierende Hepatitis-B-Virus-(HBV)-Varianten sollten nach Infektion einen sensitiven und quantitativen Nachweis der Reporterexpression ausgehend von der kovalent geschlossenen, zirkulären (covalently closed circular, ccc)DNA, dem persistierenden viralen Minichromosom, ermöglichen. Frühere Versuche zur Entwicklung von Reporter-(r)HBV-Varianten waren aufgrund des kleinen und komplex aufgebauten Genoms wenig erfolgreich. Das Einbringen transgener Sequenzen führt in der Regel zu multiplen Defekten, die eine Transkomplementierung mit Vollgenom-HBV-Helferplasmiden verlangen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Reportervektoren entwickelt, bei denen das HBc-Gen größteneils durch ein Transgen für Gaussia-Dura-Luciferase (Luc) ersetzt wurde. Die Replikation sollte ausschließlich von in trans bereitgestelltem HBc abhängen. Die Translation sowohl des Luc-Reporters wie auch von Pol wurde durch unterschiedliche Kombinationen von Translations-Kontrollelementen ermöglicht, d.h. 2A-Peptide, kleine interne ribosomale Eintrittsstellen (small internal ribosome entry sites, sIRESs) oder "Slip"-Sequenzen zur Induktion einer programmierten ribosomalen Leserasterverschiebung (programmed ribosomal frameshifting, PRF). Alle Vektoren wurden auf Reporterexpression, Replikation und Bildung der funktionellen Genomkonformation, der relaxierten zirkulären (relaxed circular, rc)DNA, untersucht. Ein Reporterkonstrukt, in dem Luc in-frame mit N-terminalen HBc-Resten kotranslatiert und die Pol-Transation über ein Slip-Motiv gesteuert wird, wurde weiter optimiert. Dies beinhaltete die Verkürzung der verbliebenen HBc-Restsequenz sowie die Deletion nicht-essentieller Luc-interner Sequenzen. Infektiosität und infektionsabhängige Reporterexpression wurden durch Inokulation von HepG2-NTCP-Zellen mit rHBV untersucht. Eindeutige Ergebnisse wurden zunächst durch in den rHBV-Inokula enthaltenes, während der Virusproduktion von rHBV-Plasmid transfizierten Zellen exprimiertes Luc Protein erschwert. Aus mehreren Methoden zur Entfernung oder Inaktivierung dieses Luc Proteins erwies sich ein GluC-Protease-Verdau der Inokula als am effizientesten, wobei die rHBV-Infektiosität vollständig erhalten blieb. Ansätze zur Steigerung der Virustiter beinhalteten die rHBV-Produktion durch Transduktion von Hepatomzellen mit rekombinanten Adeno-assoziiertes Virus-(rAAV)-rHBV-Partikeln sowie die lentivirale Integration einer rHBV-kodierenden TetON-Expressionskassette in das Genom von HepG2-HBc-Zellen, die konstitutiv HBc exprimieren. Schlussendlich wurden die besten Ergebnisse jedoch mittels konventioneller Kotransfektion unter Anwendung eines optimierten Protokolls erzielt. Andere Quellen als cccDNA für die Luc-Expression wurden experimentell durch Mutationsanalysen ausgeschlossen, einschließlich durch rHBV-Mutanten mit Defekten in der Bildung von rcDNA, dem authentischen cccDNA-Vorläufer. Die Eignung von rHBV als wt HBV-Surrogat wurde durch den Nachweis der antiviralen Wirkung zweier Kapsid-Assemblierungs-Modulatoren (capsid assembly modulators, CAMs) demonstriert, wobei die Lumineszenz vergleichbare Ergebnisse wie die Expression des HBV-Oberflächenantigens (surface, HBs) und des e-Antigens (HBe) nach einer wt HBV-Infektion zeigte. Darüber hinaus produzierte die Transkomplementation von rHBV mit HBc-Varianten mit Mutationen der hydrophoben Tasche, L60G und L60W, nackte Kapside, aber keine umhüllte Virionen, analog zu früheren Ergebnissen mit wt HBV. Eine Inokulation mit rHBV L60G oder rHBV L60W erzeugte dementsprechend keine Lumineszenz. Mit rHBV als Werkzeug zur Identifizierung neuer antiviraler Substanzen wurde die Wirkung des zyklischen Decapeptids Antamanid aus dem Pilz Amanita phalloides auf die HepG2-NTCP-Infektion analysiert, wobei mikromolare Konzentrationen dosisabhängig die Reporteraktivität verringerten. Schließlich wurden in einem knockdown-Ansatz zelluläre Wirtsfaktoren, darunter bereits beschriebene HBV-Interaktionspartner wie auch neue Kandidaten, durch lentivirale Expression von shRNAs in HepG2-NTCP Zellen gezielt herabreguliert, um ihren Einfluss auf die Bildung von cccDNA zu untersuchen. Die Inokulation dieser Zellpools identifizierte u.a. die Flap-Endonuklease 1 (FEN1) als cccDNA-relevanten Wirtsfaktur, in Einklang mit früheren Studien. Somit ist rHBV auch zur Charakterisierung von HBV-Wirt-Interaktionen geeignet. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit ein neues HBV-Reportersystem entwickelt, welches eine sensitive und quantitative Detektion der cccDNA-Bildung nach Infektion ermöglicht. Validierung und Optimierung erfolgten im HepG2-NTCP-Zellkultursystem, dem derzeit primären Infektionsmodell. Dabei reproduzierte rHBV diverse, zuvor für wt HBV beschriebene Ergebnisse und demonstrierte damit sein Potenzial als wt HBV Surrogat. Schließlich erlaubte rHBV die Ermittlung der unbekannten antiviralen Kapazität von Antamanid. Künftig sollte dieses neue rHBV-System dazu beitragen, die komplexen Wechselwirkungen zwischen HBV und Wirt aufzuklären und ein besseres Verständnis der cccDNA-Bildung zu ermöglichen sowie die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zu fördern

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